1.细菌培养 37℃厌氧环境下培养24～48h。培养结果阳性，还应进行毒素鉴定，由于少数正常人可携带难辨梭状芽孢杆菌，而此种菌株并不产生毒素。
2.毒素鉴定 为诊断假膜性小肠结肠炎的金标准，主要采用组织细胞培养法，该法最为敏感和特异，但临床实施较困难。酶联免疫吸附法(ELISA)虽不及细胞培养敏感，但快速、简便、经济，现已应用于临床。
3.抗毒素中和试验 机制是难辨梭状芽孢杆菌毒素的细胞毒作用可被难辨梭状芽孢杆菌抗毒素中和，将抗毒素稀释后在室温或37℃时即可出现中和现象。
4.内镜检查 为诊断假膜性小肠结肠炎的快速而可靠的方法。内镜下可将PMC分3型：①结肠炎样型：可见黏膜充血、水肿，呈非特异性结肠炎样表现，多见于病情轻、病程早期、治疗及时的患者;②轻型：仍以黏膜充血、水肿为主，可见假膜，为白色斑点状，跳跃分布，周边有红晕，红晕间黏膜正常，多见于病程早期;③重型：可见许多斑片状或地图状假膜，假膜为黄色、黄白色或黄褐色，不易剥离，勉强剥离或脱落后易出血，其剥离面酷似糜烂性胃炎的内镜表现，多见于病情重、病程晚期、治疗不及时的患者。
5.X线检查 腹部X线平片可见结肠扩张、肠腔积液及指压痕。气钡灌肠双重造影可见结肠黏膜紊乱、边缘呈毛刷状以及黏膜表面有许多圆形或不规则结节状阴影，也存在指压痕及溃疡征。
