免疫印迹技术

基本信息

专科分类： 生长发育检查
检查分类： 生化检查
适用性别： 男女均适用
是否空腹： 　非空腹
手术参考价： 120元
科　室： 生长发育检查

免疫印迹技术检查简介

免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测,具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。

免疫印迹技术检查过程

(一)蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

(二)电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

(三)转移：(半干式转移)

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

(四)免疫反应：

1、用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3、弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5、弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。

7、弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。